図1　プラークアッセイ法による新型コロナウイルス不活化試験


表1 オゾラルの新型コロナウイルス不活化効果

マイクロバブルを活用した技術開発を行なう株式会社資源開発研究所(所在地：神奈川県横浜市、代表取締役社長：高橋 常二郎)は、宮崎大学(所在地：宮崎県宮崎市)に新型コロナウイルスの不活性化試験を依頼した結果、新成分「オゾラル」配合の除菌消臭水が新型コロナウイルスを不活性化することを確認しました。資源開発研究所が開発した新成分「オゾラル」は、オゾンマイクロバブルと海洋深層水ミネラルを原料とした特許製法(第6783141号等)により作られた、新しい除菌消臭水です。
精製水で希釈したオゾラルで試験を行なったところ、不活性化が確認されました。また、量産が容易なオゾラルは、今回の結果を受け、新型コロナウイルスの最も簡易かつ有効な対策手段の一つとしての製品化に道が開けたことになります。


■検証に至った背景
いわゆるコロナ禍において、除菌に注目が集まっています。以前より、資源開発研究所は、オゾラルについての研究をしてきました。オゾラルには、大腸菌やサルモネラ菌などやウイルスの不活性化に加え、8ヶ月もの持続効果があることが確認されていました。このような背景から、オゾラルは、新型コロナウイルスに対しても同様の結果を見込める可能性があると考え、新型コロナウイルスの不活性化の検証に踏み切りました。


■新型コロナウイルスに対する有効性評価
【評価ウイルス】
・新型コロナウイルス(SARS-CoV-2ウイルス)

【試験品】
・オゾラル 20・50・100倍希釈

【試験方法】
1)ウイルス液の調整
-80℃で保存したウイルス液を解凍後、25℃の滅菌リン酸緩衝液(PBS)で10倍希釈した(ウイルス力価は1.0x10(5乗) plaque-forming units (PFU)/ml)。

2)オゾラルの調整
オゾラル(原液)を25℃の滅菌蒸留水(超純水)で20倍、50倍および100倍希釈したものを使用。

3)培養細胞の調整
不活化試験の24時間前に、12ウェルマイクロプレートの各ウェル内にVero細胞浮遊液を500μlずつ接種し、炭酸ガスインキュベーター内で培養し、細胞シートを作製。

4)ウイルス不活化試験
ウイルス液30μlと希釈したオゾラル270μlをマイクロチューブ内で混合し(ウイルス液は10倍希釈)、室温で30秒間静置した後、オゾラルの活性を停止させるため、有機物である2％牛胎児血清を添加したEMEM培地900μlを添加しました(この時点でウイルス液は40倍希釈)。対照として、ウイルス液30μlと蒸留水270μl、ウイルス液30μlとオゾンの代わりに酸素を海洋深層水ニガリ液にマイクロバブルで注入したもの(酸素 MB・ニガリ水)270μl(20倍希釈で使用)の混合液を用いています。対照も混合液を作製して30秒後に2％牛胎児血清を添加したEMEM培地900μlを添加しました。それぞれVero細胞シートの各ウェル内の培養液を吸引除去した後、プラーク数を数えられるようウイルス混合液(40倍)をさらに10倍(400倍)、100倍希釈(4,000倍)し、各試験液を500μl接種しました。
続いて、プラークを形成させるため、1.5％カルボキシメチルセルロースおよび3％牛胎児血清を添加したEMEM液を重層し、炭酸ガスインキュベーター内で3日間培養した。プラークの検出は、培養液と重層液を除去後、10％ホルマリン液でVero細胞を固定し、0.2％クリスタルバイオレット液で染色して、プラーク数を計測しました。1試験液につき3回試験を行いました。
オゾラルの新型コロナウイルスに対する不活化効果は、ウイルス液と蒸留水を混合したものをVero細胞に接種した際に認められたプラーク数の平均値を100％として、被検液を用いた際の平均プラーク数の減少率で評価しました。

画像1: https://www.atpress.ne.jp/releases/240456/LL_img_240456_1.png
図1 プラークアッセイ法による新型コロナウイルス不活化試験

画像2: https://www.atpress.ne.jp/releases/240456/LL_img_240456_2.png
表1 オゾラルの新型コロナウイルス不活化効果


図1に、実際に不活化試験を行ったマイクロプレートを固定後、クリスタルバイオレットで染色したものを示しました。新型コロナウイルスがVero細胞に感染して増殖したものは、1.5％カルボキシメチルセルロースおよび3％牛胎児血清を添加したEMEM液を重層することで、白く抜けたプラークとして観察されました。
表1に新型コロナウイルスに対する不活化試験の結果を示しました。約10(4乗) PFU/mlの新型コロナウイルスとオゾラル20倍希釈液を30秒間混合すると、新型コロナウイルスは検出限界値(80 PFU/ml)以下となり、ウイルス不活化効果が確認されました。また、オゾラル50倍希釈液では約95％の不活化効果が、100倍希釈では約40％の不活化効果が認められました。一方、ウイルス液と酸素MB・ニガリ水を混合したものでは、蒸留水と混合したものと同程度のプラーク形成が認められ、ウイルス不活化効果は認められませんでした。さらに、オゾラル自体のVero細胞に対する細胞毒性は認められませんでした。
今回供試したウイルス保存原液には5％牛胎児血清が含まれており、10倍希釈したウイルス液30μlとオゾラル270μlと混合した際に0.05％の血清が含まれていました。血清のような有機物はオゾラルの殺菌活性を阻害することが確認されており、今回の試験でのウイルス不活化効果に影響を与えた可能性も考えられました。


■今後について
今回の結果から、コロナ禍の対策手段として、オゾラルを実用化、量産化を近日中に目指します。


■オゾラル
「OZORAL/オゾラル」は、特許製法により、とオゾンマイクロバブルと海洋深層水ミネラルの過酸化物を精製水で希釈した殺菌水です。人体に無害でかつ広域な殺菌スペクトルを有しています。中性 ph7-8と水と同等の能力を持ちます。通常オゾンは、自己分解作用・有機物の接触等により、極めて短寿命で保存性に向かないことが知られていました。しかし、資源開発研究所独自のオゾンマイクロバブル技術(特許製法)により、常温での長期保存に成功、その画期的な技術を用いて生まれたのが、オゾラルです。


■株式会社資源開発研究所概要
半導体・精密機器洗浄装置、オゾンマイクロバブル水などの研究開発を大学などの協力を得て行っております。上記技術に関連する国内外の特許を複数保有しております。

商号 ： 株式会社資源開発研究所
代表者 ： 代表取締役社長 高橋 常二郎
所在地 ： 神奈川県横浜市港北区新横浜2-14-6 パークシティ新横浜400
設立 ： 2006年4月
事業内容： オゾン殺菌水(オゾラル)の製造開発・機密機器半導体洗浄技術の開発
URL ： https://shigenkk.com/
情報提供元： ＠Press